實時熒光定量PCR原理及基礎知識

什么是實時熒光定量PCR (RT-PCR，qPCR)？

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）指的是在PCR進行的同時，對其過程進行監(jiān)測的能力（即實時）。因此，數(shù)據(jù)可在PCR擴增過程中，而非PCR結束之后，進行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變革。在實時熒光定量PCR (qPCR)中，反應以循環(huán)中檢測到目標擴增的時間點為特征，而非在一定循環(huán)數(shù)后目標分子累計的擴增量。目標核酸的起始拷貝數(shù)越高，則會越快觀察到熒光的顯著增加。相反，終點法檢測（也稱 “讀板檢測”）測量的是PCR循環(huán)結束時累計的PCR產(chǎn)物量。

 

關于序列檢測試劑

概述

我們開發(fā)了兩種通過使用序列檢測系統(tǒng)（SDS）儀器進行PCR產(chǎn)物檢測的試劑：

• Applied Biosystems™ TaqMan® 試劑（也稱“熒光5’核酸酶試劑”）
• Applied Biosystems™ SYBR™ Green I染料試劑

TaqMan方法

TaqMan方法通過采用熒光探針在PCR循環(huán)過程中隨著特定PCR產(chǎn)物的累計而對其進行檢測。

使用TaqMan方法的檢測類型

TaqMan方法可用于以下檢測類型：
定量，包括：

• 用于RNA定量的一步法RT-PCR
• 用于RNA定量的兩步法RT-PCR
• DNA/cDNA定量
  • 等位基因檢測
  • 通過IPC進行的正負檢測

 SYBR Green I染料試劑

SYBR Green I染料法采用了Applied Biosystems™ SYBR™ Green I染料，一種可以在PCR循環(huán)過程中隨著PCR產(chǎn)物的累計而對其進行檢測的高度特異性雙鏈DNA結合染料。TaqMan和SYBR Green I染料法為重要的區(qū)別在于SYBR Green I染料試劑可以檢測所有雙鏈DNA，包括非特異性的反應產(chǎn)物。因此這樣經(jīng)過特別優(yōu)化的反應體系，對于獲取準確的結果而言是非常必要的。

使用SYBR Green I染料法的檢測類型

SYBR Green I染料法可用于以下檢測類型：

• 用于RNA定量的一步法RT-PCR
• 用于RNA定量的兩步法RT-PCR
• DNA/cDNA定量

TaqMan試劑

背景

初，使用嵌入式染料進行實時熒光PCR (qPCR) 產(chǎn)物定量。但這些染料存在重大缺點，即會同時檢測特異性以及非特異性PCR產(chǎn)物的擴增量。

TaqMan方法的開發(fā)

通過引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的熒光標記探針，實時定量PCR系統(tǒng)得到了顯著提升。這些熒光探針的使用，使得實時定量的方法得到了發(fā)展，實現(xiàn)了僅對特定擴增產(chǎn)物的檢測。此外，熒光標記探針的開發(fā)，也免去了用于探針降解分析的PCR反應后處理過程。

TaqMan序列檢測方法的工作原理

TaqMan試劑通過采用熒光探針在PCR循環(huán)過程中隨著特定PCR產(chǎn)物的累計而對其進行檢測。工作原理：

步驟、過程

1. 構建一段寡核苷酸探針：5’端標記熒光染料報告基團，3’端標記淬滅染料基團。當探針保持完整時，淬滅基團的靠近會通過空間上的熒光共振能力轉移（FRET）而顯著降低由報告染料基團發(fā)射的熒光。
2. 如果存在目標序列，探針便會在其中一個引物結合位點的下游發(fā)生退火，并隨著引物的延伸通過Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性，完成切除。
3. 探針的切除將會引起：
   • 將報告染料基團和淬滅染料基團進行分離，增強了報告染料基團的信號。
   • 將探針從目的鏈上去除，使引物繼續(xù)沿模板鏈末端延伸。因此，探針的介入并不會抑制整個PCR過程。
4. 每經(jīng)過一個循環(huán)，就會有更多的報告基因染料分子從各自的探針上切斷，熒光強度會隨著合成的擴增片段數(shù)量的增加而增加。



兩種類型的 TaqMan 探針

我們可提供兩種類型的Applied Biosystems™ TaqMan® 探針：

• TaqMan探針（含有Invitrogen™ TAMRA™染料——淬滅染料基團）
• Applied Biosystems™ TaqMan® MGB探針

推薦用于等位基因檢測的 TaqMan MGB 探針

我們一般推薦使用TaqMan MGB探針進行等位基因分型分析，特別是當傳統(tǒng)TaqMan探針超過30個核苷酸時。TaqMan MGB探針包含：

• 位于3 '端的非熒光淬滅基團——由于淬滅基團不發(fā)出熒光，因此SDS儀可以更地檢測出報告基因染料 。
• 位于3’ 端的小溝結合物 – 小溝結合物可提高探針的熔解溫度（Tm），縮短探針的長度。

終，TaqMan MGB 探針會在匹配和未匹配探針之間展現(xiàn)出更大的 Tm 值差異，從而提供更準確的等位基因分型。

TaqMan 方法的優(yōu)點

TaqMan方法的優(yōu)點如下：

• 需要在探針和目標分子（靶點）之間發(fā)生特異性的水解（雜交），方可生成熒光信號
• 您可使用明顯不同的報告基因染料標記探針，在一個反應管內擴增并檢測兩個不同的序列
• 無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。

TaqMan方法的缺點：

TaqMan方法的主要缺點在于需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針。

 

SYBR Green I染料試劑

背景

一般將可與雙鏈DNA發(fā)生結合的小分子分為以下兩類：

• 嵌入劑
• 小溝結合物

無論哪種結合方法，用于PCR實時檢測的DNA結合染料都需要滿足以下兩個條件：

• 結合至雙鏈DNA時，會有增強的熒光
• 對 PCR 不會產(chǎn)生抑制

我們開發(fā)更加優(yōu)化的條件，使得SYBR Green I染料的使用不會對PCR產(chǎn)生抑制并帶來相對于溴化乙錠更為靈敏的檢測。

SYBR Green I染料法的工作原理

SYBR Green I染料法通過SYBR Green I染料與PCR過程中產(chǎn)生的雙鏈DNA結合，而對聚合酶鏈反應（PCR）的產(chǎn)物進行檢測。工作原理：

步驟、過程

當SYBR Green I染料被加入到樣品中后，它可立即與樣品中的雙鏈DNA進行結合 。

1. 在PCR過程中，Applied Biosystems™ AmpliTaq Gold™DNA聚合酶可對目標序列進行擴增，以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，即“擴增子”。
2. 隨后，SYBR Green I染料會與每一個新產(chǎn)生的雙鏈DNA分子進行結合。
3. 隨著PCR的進行，越來越多的擴增子被生成。由于SYBR Green I染料可與所有的雙鏈DNA結合，因此熒光強度也會隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加。

SYBR Green I染料法的優(yōu)點

SYBR Green I染料法的優(yōu)點如下：

• 它可用于監(jiān)測任何雙鏈 DNA 序列的擴增。
• 無需探針，降低了檢測的設置和運行成本。

SYBR Green I染料法的缺點：

SYBR Green I染料法的大缺點在于可能會產(chǎn)生假陽性信號；即，因為SYBR Green I染料可與任何的雙鏈DNA發(fā)生結合，因此也會與非特異性的雙鏈DNA序列發(fā)生結合。

其他注意事項

采用DNA結合染料的另一原因，是多重染料與單一擴增分子的結合。這可提高擴增產(chǎn)物檢測的靈敏度。基于多重染料的結合，將迎來信號量取決于在反應中所產(chǎn)生的雙鏈DNA量的局面。因此，如果擴增效率相同，相較于對較短產(chǎn)物的擴增，對較長產(chǎn)物的擴增將會產(chǎn)生更多的信號。這*不同于熒光探針，使用熒光探針時，對于每個合成的擴增分子淬滅僅釋放一個熒光基團，與其長短并不相關。

 

關于定量檢測

什么是定量檢測？

定量檢測是一種實時的PCR (qPCR) 檢測。測量（定量）每輪PCR擴增循環(huán)中，檢測目標核酸片段的量。目標分子可以為DNA、cDNA或RNA。此方法指南主要對以下三種定量檢測進行討論：

• DNA/cDNA定量
• 采用一步法逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）的RNA定量
• 采用兩步法RT-PCR的RNA定量

定量分析常見術語

擴增子：PCR過程而產(chǎn)生的DNA短片段
擴增曲線：根據(jù)熒光信號相對于循環(huán)數(shù)而制作的曲線
基線：PCR起始時，熒光信號還未發(fā)生變化的幾個循環(huán)
Ct（閾值循環(huán)）：熒光信號超過NTC（無模板對照樣品）固定閾值時的循環(huán)數(shù) 。用于對擴增質量進行驗證。
核酸目標：（也稱為“目標模板”）——需要擴增的DNA或RNA序列
惰性參比染料： 一種可作為內部對照，以用于在數(shù)據(jù)分析時對報告基團染料信號進行均一化的染料。均一化是對因濃度或體積變化而隨之引起波動進行的必要校正。所有的SDS PCR試劑盒都提供了參比熒光對照。
Rn（均一化報告基團）：報告基團染料釋放的熒光強度除以惰性參比染料釋放的熒光強度
Rn+: 一次反應的Rn值包含所有的組分，包括模板
Rn-：未反應樣品的Rn值。Rn值可通過以下方式獲?。?/p>

• 實時熒光定量PCR (qPCR) 運行的早期循環(huán)（產(chǎn)生可被檢測的熒光信號之前的循環(huán)），或
• 不含有任何模板的反應

ΔRn (delta Rn): 在特定PCR條件設置下所產(chǎn)生的信號量級。
ΔRn可通過以下公式計算：(Rn+) – (Rn-)標準品 具有已知濃度的A樣本，用于繪制標準曲線。通過使用不同濃度的標準品，您可構建用于未知樣品定量分析的標準曲線。
閾值：早期PCR循環(huán)時Rn值的平均標準差，乘以相應的校正系數(shù)閾值應當設定在PCR指數(shù)擴增時的相關區(qū)域。
未知：具有未知模板量的樣品。即，您需要進行檢測的樣品。

實時PCR (qPCR) 定量檢測工作原理

在PCR的起始循環(huán)中，熒光信號幾乎不發(fā)生變化。從而定義為擴增曲線中的基線。而超出基線部分的熒光的增加，則為對累計目標分子的檢測。固定的熒光閾值線，可設置在基線之上。熒光超過固定閾值時的循環(huán)數(shù)則為參數(shù)CT（閾值循環(huán)）。

 

與相對定量

概述

當對定量檢測的結果進行計算時，可以采用或相對定量。

什么是定量？

定量檢測是根據(jù)標準曲線對未知樣品進行的定量。

示例

定量可根據(jù)病毒的拷貝數(shù)，監(jiān)控疾病狀態(tài)。研究者須知道特定生物學樣品中目標RNA分子的準確拷貝數(shù)，以對疾病的進展進行監(jiān)測。定量可通過從所有SDS儀器獲取的數(shù)據(jù)進行，但注意標準品的定量則須首先通過其他方法獲取。

什么是相對定量？

相對定量用于分析特定樣品相對于參照樣品（比如，未處理的對照組）某個基因表達量的變化。

示例

相對定量可用于檢測化合物（藥物）引起的基因表達改變。經(jīng)化學處理樣品中的特定目標基因的表達水平可與相對未處理樣品中的基因表達水平進行比較。

相對定量的計算方法

相對定量可根據(jù)從所有SDS儀器獲取的數(shù)據(jù)而進行。用于相對定量的計算方法有：

• 標準曲線法
• 比較CT法

確定使用哪種方法 所有方法都可產(chǎn)生同等的結果。當在確定使用哪種方法時，需要注意：

• 在不同的反應管中進行目標分子和內源性對照的擴增時，采用標準曲線法進行分析，所需優(yōu)化和驗證操作少。
• 采用比較CT法時，則須進行驗證實驗，以表明目標分子和內源性對照擴增的效率基本相同。比較CT法的優(yōu)勢在于無需標準曲線，從而可以實現(xiàn)通量提高（因為無需額外的孔用于標準曲線的繪制）；并消除在進行標準曲線繪制時因稀釋錯誤所帶來的不利結果。
• 如需將靶標和內源性對照品在同一管內進行擴增，則須優(yōu)化并限制引物的濃度以避免對 CT 值產(chǎn)生影響。當在一管中進行雙重反應時，可以提高通量并減少移液失誤所帶來的不利影響。

常用術語

和相對定量中常用的術語，如下：

標準：用于構建標準曲線的已知濃度樣品。
參考文獻：用于對實驗結果進行均一化的陰性或陽性信號。內源性和外源性對照是常見的陽性對照。陽性對照指的是因 PCR擴增 而產(chǎn)生的信號。陽性對照則具有自己的引物和探針組合。
內源性對照：指的是，在每個樣品進行提取時便已存在于樣品中的RNA或DNA。當采用內源性對照作為陽性對照時，您可通過對信使RNA（mRNA）的均一化定量來消除每次反應中加入的總RNA量的差異。
外源性對照：指的是，在每個樣品中加入的具有已知濃度的特殊RNA或DNA。外源性陽性對照通常是來自可以作為內部陽性對照（IPC）的體外成分，可區(qū)分真正的目標陰性和PCR抑制。此外，外源性對照還可均一化樣品提取或逆轉錄中互補DNA（cDNA）合成的效率差異。無論是否使用陽性對照，使用含有ROX染料的參比熒光對照都是十分重要的，因為它可以對非PCR相關的熒光信號波動進行均一化。
目標分子的均一化量：一個可以用于比較不同樣品中目標分子相對量的無單位數(shù)字。
校準品：可以用作比較結果基礎的樣品。

 

用于相對定量的標準曲線法

概述

因采用的是相對于基礎樣品的表達量，例如校準品，用于相對定量的標準曲線一般都比較容易繪制。對于所有的實驗樣品，其目標分子的量均是從標準曲線獲取，然后除以校準品的目標分子量而確定的。因此，校準品便成為1 X 樣品，而所有其他的量則都為以n倍校準品來表示。例如，在研究藥物對表達產(chǎn)生的影響時，未處理的對照樣品便是合理恰當?shù)男势贰?/p>

關鍵指南

以下指南可為相對定量中標準曲線的正確使用，提供關鍵指導：

• RNA或DNA儲存液的準確稀釋是十分重要的，但用于表達稀釋的單位是無關的。如果對來自對照細胞系的總RNA進行了2倍的稀釋后進行標準曲線的繪制，則單位應該是稀釋值1、0.5、0.25、0.125等。如果使用相同的 RNA 或 DNA 儲存液進行不同板上的標準曲線繪制，則可在不同板之間比較確定的相對定量。
• 也可使用DNA標準曲線進行RNA的相對定量。這么做需要假設目標分子在所有樣品中的逆轉錄效率都是相同的，但并不需要知道效率的值。
• 在采用內源性對照進行定量均一化時，應該對目標分子和內源性對照都進行標準曲線的繪制。對于每一個實驗樣品，目標分子和內源性對照的量都是根據(jù)合適的標準曲線而確定的。因此，目標分子的量除以內源性對照的量便是均一化后的目標分子值。同樣的，其中的一個實驗樣品便是校準品，或1×樣品。每一個均一化的目標分子值除以校準品的均一化值后便是相對的表達水平。

內源性對照

對于內源性對照進行擴增可用于對加入至反應的樣品RNA或DNA的量進行標準化。對于基因表達定量，研究者采用過 ß-肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、核糖體RNA（rRNA）或其他RNA作為內源性對照。

標準品

由于樣品量會除以校準品的量，則標準曲線中的單位便被去除了。因此，對于標準品來說所有需要知道的只是它們的相對稀釋比。對于相對定量，任何含有合適目標分子的RNA或DNA儲存液都可用作標準品。

 

用于相對定量的比較CT法

比較CT法與標準曲線法相似，只是它利用的是算術公式2−ΔΔCT來獲取相同的相對定量結果。

算術公式：

為了有效地利用比較 CT 法，目標分子（基因）和對照（內源性對照）的擴增效率應當近似相同。 
更多關于使用比較CT法進行相對定量的信息，請參閱用戶手冊#2：基因表達的相對定量（PN4303859）。

 

用于定量的標準曲線法

概述

用于定量的標準曲線法與用于相對定量的標準曲線法類似，只是標準品的量必須首先通過其他獨立方法獲取。

關鍵指南

下面的指南對于定量中標準曲線的正確使用十分關鍵：

• 來自單一、純凈物種的DNA或RNA是十分重要的。例如，從大腸桿菌制備的質粒DNA通常都會存在RNA的污染，這會增加A260的讀數(shù)而增加質粒的拷貝數(shù)計算結果。
• 準確的移液是必需的因為標準品需要經(jīng)過不同的數(shù)量級的順序稀釋。質粒DNA或體外轉錄的RNA必須被濃縮以便獲取準確的A260測量值。濃縮的DNA或RNA隨后必須被稀釋106–1012倍以獲得與生物學樣品中目標分子相似的濃度。
• 稀釋的標準品的穩(wěn)定性也需要引起注意，特別是對于 RNA。將稀釋的標準品分裝至多份，儲存在-80°C，并僅在使用前才進行解凍。

 無法使用DNA作為RNA定量的標準品，因為對于逆轉錄過程的效率沒有對照。

標準品

標準品的量必須首先通過其他獨立的方法獲取。質粒 DNA 和體外轉錄的 RNA 通常用于制備標準品。濃度可在A260 處被測量得到，并通過使用DNA或RNA的分子量轉化成拷貝數(shù)。